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高分文献神器-3D类器官

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类器官 (Organoids)大事件:

 2009年荷兰Hans Clevers研究团队证实了体外培养的肠道干细胞能够形成类器官
• 2014年《Cell》:纪念斯隆-凯特琳癌症中心的Yu Chen研究组将类器官引入肿瘤,首次证实可在实验室培育出源自人类前列腺肿瘤的类
   器官,且它的组织结构与它们起源的转移灶样本高度相似
• 2015年MIT科技评论十大科技突破之一
 
• 2017年《Nature Methods》:评价3D类器官为2017年生命科学领域的年度技术
• 2018年2月《Science》: Valeri博士带领的研究团队,首次证明类器官可以准确预测抗癌药物对患者的疗效
• 2018年4月《Nature Reviews Cancer》:介绍了类器官在癌症研发中如在癌症个体化医疗、肿瘤的机制研究、肿瘤免疫治疗等领域的应用
  潜力
• 2019年全球有超过 100 家实验室正在用不同的类器官模型开展包括肿瘤在内的其他疾病的研究,以探究类器官在药物筛选、抗肿瘤药物试
   验以及检测药物的敏感性和耐受 性乃至疾病的成因。 

 
 
3D类器官的优势?
传统的2D培养虽然有很多优点,但这些模型缺乏维持原位细胞特性所必须的细胞与细胞,细胞与基质之间的互相作用。而通过纯化分离所得的原代细胞在体外培养之后也会失去其原有的功能和特性;
“ 2D细胞难以复制肿瘤生长的微环境,小鼠体内模型又相对耗时耗力 ”

现有的3D培养的球体形成实验:往往缺乏能自我增殖及分化的干细胞和祖细胞;
“ 3D类器官培养——高效便捷的方案,强大的研究工具 ”

类器官的分类:
• 组织干细胞衍生的类器官:由成体干细胞刺激分化成类器官
• 多能干细胞衍生的类器官:多能干细胞类器官的培养相较成体干细胞类器官而言, 需要先将多能干细胞向相应靶器官所在胚层诱导。
 
以多能干细胞培育肠类器官为例。在肠道的发育过程中, TGF-β超家族成员中的Nodal信号通路能促进原肠胚向内胚层发育[1], 形成的内胚层进一步发育成包含前肠(foregut)、中肠(midgut)、后肠(hindgut)的原始肠管[2]。前肠形成口腔、肝脏、 胰腺等器官, 中肠形成小肠和升结肠, 后肠形成直肠和余下的部分结肠。Wnt信号通路和成纤维细胞生长因子(FGF)可以抑制内胚层向前肠分化, 从而向中肠和后肠发育[3-4]。利用这些发育特性, 研究人员首先利用Nodal的等效物activin A激活干细胞内TGF-β信号通路, 促使干细胞向内胚层分化。接着再添加FGF4和Wnt3a, 使其特异性地向后肠分化, 形成后肠球状细胞体。将形成的球状细胞体加入到前文所述的小鼠成体肠干细胞培养体系, 即包埋入基质胶, 添加EGF、Noggin和R-spondin, 结果成功形成包含各种肠上皮细胞的成熟肠类器官[5-6]。利用这个思路和方法, 多能干细胞来源的不同组织特异性类器官相继被建立起来, 如胃[7]、肺[8]、肝[8]和肾[8]等。

小肠类器官的培养流程

1、 Siim Pauklin, Ludovic Vallier. Activin/Nodal signalling in stem cells. Development 2015; 142(4): 607-19. 
2、 Heath JK. Transcriptional networks and signaling pathways that govern vertebrate intestinal development. Curr Top Dev Biol
      2010; 90: 159-92. 
3、 McLin VA, Rankin SA, Zorn AM. Repression of Wnt/betacatenin signaling in the anterior endoderm is essential for liver and
       pancreas development. Development 2007; 134(12): 2207-17. 
4、 Dessimoz J, Opoka R, Kordich JJ, Grapin-Botton A, Wells JM. FGF signaling is necessary for establishing gut tube domains
      along the anterior-posterior axis in vivo. Mech Dev 2006; 123(1): 42-55. 
5、 Spence JR, Mayhew CN, Rankin SA, Kuhar MF, Vallance JE, Tolle K, et al. Directed differentiation of human pluripotent stem
      cells into intestinal tissue in vitro. Nature 2011; 470(7332): 105- 9. 
6、 Cao L, Gibson JD, Miyamoto S, Sail V, Verma R, Rosenberg DW, et al. Intestinal lineage commitment of embryonic stem cells.
      Differentiation 2011; 81(1): 1-10. 
7、 McCracken KW, Catá EM, Crawford CM, Sinagoga KL, Schumacher M, Rockich BE, et al. Modelling human development and
      disease in pluripotent stem-cellderived gastric organoids. Nature 2014; 516(7531): 400-4. 
8、 Lancaster MA, Knoblich JA. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.
      Science 2014; 345(6194): 1247125. 


• 肿瘤干细胞衍生的类器官:
肿瘤研究模型包括肿瘤细胞系和人源肿瘤组织异种移植模型PDX(patient derived xenograft)。这两种模型都有其局限性: 
肿瘤细胞系在体外培养过程中, 肿瘤生长的微环境缺少了细胞基质、非肿瘤细胞等间质成分, 不能准确反映出原代肿瘤异质性、组织病理表现以及遗传特征; PDX是将患者来源的肿瘤组织移植到免疫缺陷的小鼠体内, 这种模型技术难度大, 成本高, 培养周期长, 限制了它的应用。
 
肿瘤类器官的培养方法:
1.运用于肿瘤组织的培养, 形成肿瘤组织来源的类器官。将取得的肿瘤组织直接培养形成类器官, 其可以很好地保持肿瘤的特性。
2.将患者的肿瘤细胞经重编程为多能干细胞, 然后再诱导分化形成与原始肿瘤相同的肿瘤细胞, 再经体外3D培养形成类器官[9]。这种方式培养肿瘤类器官的效率取决于癌组织类型或者某种特定的致瘤突变, 而且, 形成的类器官可能只是肿瘤的亚克隆, 失去原代肿瘤的遗传异质性[10]。肿瘤类器官的培养与成体干细胞来源的类器官培养稍有不同。
9、 Huang L, Holtzinger A, Jagan I, BeGora M, Lohse I, Ngai N, et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using
       human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nat Med 2015; 21(11): 1364-71. 
10、 Papapetrou EP. Patient- derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nat Med 2016;
         22(12): 1392-401.
 
以人结直肠癌类器官(colorectal cancer organoids)培养为例, 因肿瘤组织存在Wnt信号通路持续性激活的突变[11], 培养过程中无需外源性地加入Noggin和R-spondin蛋白, 而EGF也并非为所有类型肿瘤组织必需[12]。运用类器官的培养方法,已经有多种癌组织, 包括结肠癌[12,13]、胰腺癌[14]、肝癌[15]、前列腺癌[16]、乳腺癌[17]的类器官被建立。这些培养形成的肿瘤类器官在表型和遗传性质上与原始肿瘤组织十分相像, 在探究肿瘤形成的机理及治疗上将发挥巨大的作用。
11、 Muzny DM, Bainbridge MN, Chang K, Dinh HH, Drummond JA, Fowler G, et al. Comprehensive molecular characterization of
        human colon and rectal cancer. Nature 2012; 487(7407): 330- 7. 
12、 Sato T, Stange DE, Ferrante M, Vries RG, Van Es JH, Van den Brink S, et al. Long-term expansion of epithelial organoids from
        human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology 2011; 141(5): 1762-72. 
13、 van de Wetering M, Francies HE, Francis JM, Bounova G, Iorio F, Pronk A, et al. Prospective derivation of a living organoid
        biobank of colorectal cancer patients. Cell 2015; 161(4): 933-45.
14、 Gao D, Vela I, Sboner A, Iaquinta PJ, Karthaus WR, Gopalan A, et al. Organoid cultures derived from patients with advanced
        prostate cancer. Cell 2014; 159(1): 176-87.
15、 Broutier L, Mastrogiovanni G, Verstegen MM, Francies HE, Gavarró LM, Bradshaw CR, et al. Human primary liver
        cancer 
derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nat Med 2017; 23(12): 1424-35. 
16、 Drost J, Karthaus WR, Gao D, Driehuis E, Sawyers CL, Chen Y, Clevers H. Organoid culture systems for prostate epithelial
        and cancer tissue. Nat Protoc 2016; 11(2): 347-58
17、Sachs N, de Ligt J, Kopper O, Gogola E, Bounova G, Weeber F, et al. A living biobank of breast cancer organoids captures
       disease heterogeneity. Cell 2018; 172(1/2): 373-86.e10. 
 
类器官的应用:
 
▶ 细胞分化行为研究的模型:
如脑组织类器官的建立, 可以帮助观察神经干细胞独特的分化过程。
 18、Lancaster MA, Renner M, Martin CA, Wenzel D, Bicknell LS, Hurles ME, et al. Cerebral organoids model human brain
       
development and microcephaly. Nature 2013; 501(7467): 373-9. 

▶ 组织结构异常相关疾病研究的模型:
类器官与体内器官功能和结构类似, 可以用于模拟致病过程, 包括感染性疾病、遗传性疾病和退行性疾病等模型。如用幽门螺旋杆菌感染胃类器官, 可以探究幽门螺旋杆菌的感染机制。
19、Bartfeld S, Bayram T, van de Wetering M, Huch M, Begthel H, Kujala P, et al. In vitro expansion of human gastric epithelial
       stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology 2015; 148(1): 126-36.e6.

▶ 肿瘤发生机制研究的模型:
Nadauld等通过shRNA敲低Cdh1–/–、Tp53–/– 小鼠胃类器官TGFBR2基因的表达, 发现形成的类 器官细胞具有明显的侵袭和转移特性, 揭示了TGFBR2在癌转移中可能扮演的作用。
20、Nadauld LD, Garcia S, Natsoulis G, Bell JM, Miotke L, Hopmans ES, et al. Metastatic tumor evolution and organoid modeling
       implicate TGFBR2 as a cancer driver in diffuse gastric cancer. Genome Biol 2014; 15(8): 428.

▶ 药物筛选的模型:
许多药物在人体内的代谢过程中会对某些敏 感器官如肝、肾等造成严重损伤, 因此需要临床前药物筛选来评价药物疗效和安全性。
21、Emmink BL, Van Houdt WJ, Vries RG, Hoogwater FJ, Govaert KM, Verheem A, et al. Differentiated human colorectal 
       
cancer cells protect tumor-initiating cells from irinotecan. Gastroenterology 2011; 141(1): 269-78.

▶ 组织器官损伤修复的材料来源:
Fordham等将鼠小肠类器官移植回小鼠体内, 发现类器官可以修复原来损伤的组织并发挥功能。
22、Fordham RP, Yui S, Hannan NR, Soendergaard C, Madgwick A, Schweiger PJ, Nielsen OH, et al. Transplantation of expanded
       fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell 2013; 13(6): 734-44. 
23、Yui S, Nakamura T, Sato T, Nemoto Y, Mizutani T, Zheng X, et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in
       vitro from a single adult Lgr5+ stem cell. Nat Med 2012; 18(4): 618- 23.

上海优宁维生物科技股份有限公司可提供完整的类器官解决方案 
 
包含基质胶、培养基和基础培养基添加物、细胞因子和小分子化合物

• 不同类器官培养应用的生长因子和小分子
 
类器官 生长因子 小分子
小肠/结肠类器官  EGF、Noggin、R-Spondin 1、Wnt-3a A 83-01、Gastrin、Nicotinamide、SB 202190、Y 27632
胃类器官 FGF-10、 EGF、Noggin、R-Spondin 1、Wnt-3a A 83-01、Gastrin、Nicotinamide、SB 202190、Y 27632
肝脏类器官 BMP-4、EGF、FGF-basic、FGF-10、HGF、Noggin、Wnt-3a
A 83-01、DAPT、Forskolin、Gastrin、Nicotinamide、
Y 27632、Prostaglandin E2
肺类器官 Activin A、FGF-basic、FGF-4、Noggin CHIR 99021、SB 431542
前列腺类器官 EGF、Activin A、FGF-basic、FGF-10、Noggin、R-Spondin 1、Wnt-10b A 83-01、SB 202190、Y 27632、Prostaglandin E2、Nicotinamide、Testosterone
胰腺类器官 FGF-10、 EGF、Noggin、R-Spondin 1、Wnt-3a A 83-01、Nicotinamide、Gastrin
肾类器官  BMP-2、BMP-4、BMP-7、FGF-basic、FGF-9 CHIR 99021、Retinoic Acid
乳腺类器官 Heregulinβ-1、R-Spondin 1、R-Spondin 2、Noggin、EGF、 FGF-basic、FGF-10、Wnt-3a Prolactin、Y 27632
脑类器官  FGF-basic、Noggin、DKK-1、 EGF、BDNF、GDNF MK-2206、GDC-0068、Dorsomorphin、Y 27632
视网膜类器官 SHH、Wnt-3a CHIR 99021、Y 27632
内耳类器官 BMP-4、 FGF-basic A 83-01、SB 431542

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